荧光定量PCR是目前分子生物学研究中常使用的技术手段之一，但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题，为了更好地指导研究生的实验教学，结合我们实验室的经验，特将qPCR 常见问题及解决方案总结如下：
①扩增曲线不稳定
可能原因：RNA 纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。
解决方案：
提取高纯度的 RNA，小心操作；
对仪器进行校准；
②扩增无法达到平台期
可能原因：模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。
解决方案：
提高模板量；
提高循环数；
用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。
③荧光下降
可能原因：存在降解；模板浓度过高。
解决方案：
提高体系纯度；
降低模板量；
降低荧光阈值。
④单峰，峰不尖锐
可能原因：与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。
解决方案：
温度跨度不高于 7 度，视为可用结果；
进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。
⑤单峰，Tm 低于 80 度
可能原因：只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。
解决方案：
检查是否加入模板；
进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确。
⑥双峰，较低峰 Tm 在 80 度之前
可能原因：由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。
解决方案：
适当提高退火温度；
提高模板量，降低引物浓度；
重新设计引物。
⑦严重双峰，Tm 都在 80 度以后
可能原因：引物特异性过差或交叉污染。
解决方案：
BLAST 检查引物特异性，重新设计引物；
在超净台中，换用移液器分别加入引物，避免交叉污染。
⑧其他非正常熔解曲线
可能原因：应体系污染、试剂失效；耗材与仪器不匹配，检测通道不正确；仪器长时间未做矫正。
解决方案：
在无模板洁净区内配制体系；
避免将试剂暴露在强光或高温下；
避免试剂过期；
做好阳性、阴性对照；
选用与仪器匹配的耗材；
定期请工程师进行仪器校准。
⑨标准曲线线性关系不佳
可能原因：加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不佳；PCR 酶灵敏度不高及活力下降。
解决方案：
标准品加样体积大于 2ul、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选择硅化枪头，使用文库稀释液稀释标准品，降低耗材管壁对 DNA 吸附；
避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品；
改变稀释，增加稀释梯度；
更换灵敏度更高，线性关系更好的试剂，校正-20℃冰箱，使用时将酶置于冰上。
义翘神州提供实时荧光定量PCR技术服务，其优势
①为您提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法，根据您的科研需求进行基因表达分析。
②通过qPCR技术完成定量分析、相对定量分析或定量分析。
③有现货基因产品近28,000种，具有高质量和经过验证的引物对，提高了检测效率。
④经验丰富的技术人员设计qPCR检测方案，并提供实验服务。