实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

 

 

一、实时荧光定量PCR使用方法

 

1、样品准备：首先将样品进行细胞分离，提取细胞总DNA或mRNA，然后将细胞总DNA或mRNA转换为cDNA，将cDNA作为PCR反应的模板。

 

2、PCR反应：将样品cDNA混合物，PCR引物，PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶等混合在一起，在PCR反应管中加入荧光探针，然后将反应管放入PCR仪中，按照PCR反应的温度曲线进行反应，将反应管放入荧光检测仪中进行检测。

 

3、检测：在荧光检测仪中，按照设定的参数，实时监测PCR反应管中的荧光信号，根据荧光信号的变化，可以实时监测PCR反应的进展情况，并对样品进行定量分析。

 

二、实时荧光定量PCR使用注意事项

 

1、样品提取：根据实验目的，确定样品提取的方法，如细胞分离，细胞总DNA或mRNA提取，cDNA合成等，以确保终检测的准确性。

 

2、PCR反应：在PCR反应中，应注意控制反应温度，反应时间，反应次数，配制反应体系时，应注意控制反应体系的稳定性，以确保反应的准确性和可靠性。

 

3、荧光检测：在荧光检测中，应注意控制荧光探针的添加量，以确保检测的准确性，并且应注意控制检测仪器的稳定性，以确保检测的准确性。

 

4、数据分析：在数据分析中，应注意控制参考样品的添加量，以确保数据的准确性，并且应注意检测的结果是否符合实际情况，以确保数据的可靠性。

 

实时荧光定量PCR技术是一种非常有效的检测技术，它可以用于检测和定量分析样品中特定基因的表达水平，但在使用过程中，还需要注意以上几点，以确保实验的准确性和可靠性。

 

5、实验重复性和可重复性：

为了确保实时荧光定量PCR结果的准确性和可靠性，需要进行多次重复实验。重复实验可以检测实验的随机误差和系统误差。同时，实验设计应考虑可重复性，以确保不同实验条件下的结果具有可比性。

 

6、质量控制：

在进行实时荧光定量PCR时，需要建立严格的质量控制体系。质量控制包括对试剂、仪器、实验操作过程以及数据分析过程的质控。通过质量控制可以及时发现并纠正实验中存在的问题，确保实验结果的准确性和可靠性。

 

总之，实时荧光定量PCR是一种灵敏且可靠的分子生物学技术，在生物医药领域具有广泛的应用价值。为了确保实验结果的准确性和可靠性，需要在实验设计、样品处理、反应条件、数据分析、实验重复性和可重复性以及质量控制等方面进行充分考虑和优化。