一抗(primary antibody)是一种免疫球蛋白,能特异性结合特定蛋白或重点研究的其他生物分子,目的是对其进行纯化、检测和测量。使用小鼠、大鼠、兔子、山羊和其他动物作为寄主,可将一抗培育成多克隆(pAb)或单克隆抗体(mAb)。在实验时选择一抗可根据以下几个方面进行考虑:
①确定实验种属和类型:
明确实验所需的样本种属,如人、鼠、猪等,应选择物种相同或有交叉反应的抗体。
确定实验类型,如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等,一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过,适用于何种分析类型,如未提及并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型,而是说明尚未经过此种分析试验验证。如果抗体不适用某些分析试验,则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
②抗体类型
单克隆抗体:由单一B淋巴细胞产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体。单抗实验时可产生极少或无背景染色,同时可减少与非目的蛋白的交叉反应。
多克隆抗体:由动物的多个B细胞克隆产生,是具有针对抗原几个表位的多种抗体混合物。多抗可识别抗原的微小变异,能够产生更强的抗原检测信号,是涉及变性蛋白质实验抗体。
③分析样本蛋白的结构性质
分析了解样本蛋白的结构性质有助于选择合适的抗体,抗体说明书一般有相关免疫原的描述。若打算检测的是蛋白片段或是一种特殊的同型物又或是蛋白全长的某一区域,则必须选择用含有此片段域的免疫原制备的抗体。
④抗体宿主物种的选择
一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要。对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,好选兔源的一抗,二抗则可选择偶联了检测分子(酶、荧光素、生物素等)的抗兔IgG。
如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况,除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法,则抗体宿主物种的影响不大。