生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了获得大量的目的蛋白，我们可以通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到某个宿主细胞，使其大量表达。这种将克隆化基因插入合适载体后导入宿主细胞用于表达大量蛋白质的方法一般称为蛋白质表达技术。蛋白质表达技术在蛋白质纯化、定位，蛋白质的结构域分析及蛋白质的体外功能分析等方面都有应用。

 

按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。原核表达系统有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统。真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物细胞表达系统。根据目的蛋白质的情况选择合适的表达系统。

 

常用的表达系统主要是大肠杆菌表达系统和哺乳动物表达系统。

 

与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、更易于生长和控制、实验技术相对简单、成本廉价、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择等优点。所以对于一个全新的基因，如果没有任何文献资料，那么首先考虑的应该是大肠杆菌表达。

 

 

原核蛋白表达流程

 

原核表达载体的构建→转化到高效表达的宿主菌→目的蛋白的诱导表达→细菌的扩大培养→制备细菌蛋白粗提物→目的蛋白质的纯化。

 

 

原核蛋白表达常见问题解析：

一、Q: 为什么目的蛋白总是以包涵体形式出现?

 

A: 在原核表达纯化中目的蛋白经常发生错误折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导后目的蛋白表达通常可达细胞总蛋白的50%以上，虽然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多达95%的蛋白则存在于包涵体。为了获得更多可溶蛋白，在实验过程中，可以降低诱导温度，例如16-30℃，或降低IPTG浓度（0.01-0.1mM）并延长诱导时间，还可以采用特别的培养基培养细菌。

 

 

二、Q: 跨膜蛋白为什么很难表达?

 

A: 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个常见问题，主要原因可能有两个：

 

1.跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式链接，形成的亲水疏水的一个简单的跨膜化学结构，这种结构和信号肽结构形似。而对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽的识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

 

2.对于疏水性片段，在原核细胞表达中非常容易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，处于生物自我保护的本能，所有细胞器都会停止合成蛋白的过程。

 

三、Q: 如何选择蛋白表达宿主菌?

 

A: 原核表达系统和真核细胞偏爱的密码子不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。蛋白表达问题及菌株选择有以下几种：

 

1.无蛋白表达或出现截短蛋白

 

可能原因是大肠杆菌的密码子偏移性。需要补充稀有密码子tRNA,或将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子。

 

建议表达菌株：Rosetta 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B, RosettaBlue

 

2.表达为包涵体蛋白

 

可能原因一是目的蛋白含有二硫键，二硫键形成困难，可以利用促进二硫键形成的各种载体标签，建议表达菌株是Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B；二是表达过快，表达量过高，可以降低诱导温度，IPTG浓度优化,建议表达菌株是Tuner, Rosetta-gami B。

 

3.蛋白无活性

 

可能原因是蛋白错误折叠。可以利用促进二硫键形成的各种载体标签，建议表达菌株是Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B，也可以降低诱导温度，IPTG浓度优化,建议表达菌株是Tuner, Rosetta-gami B。

 

4.细胞死亡，生长极困难

 

可能表达的是毒性蛋白，需要更严格的本底表达控制，建议表达菌株pLysS。

 

四、Q: 能不能说一下原核蛋白纯化方式及选择方法

 

A: 蛋白纯化方法常用的有亲和纯化、离子交换、切胶回收。

 

1.一般带有HIS,GST,SUMO,Fc等融合标签的蛋白，我们可以通过Ni柱、GST柱、protein A等进行亲和纯化，用亲和纯化方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，方便快捷。

 

2.如果不想让重组蛋白带有标签，可以先表达带标签重组蛋白，亲和纯化后用蛋白工具酶切割融合蛋白，再纯化除去工具酶。或者直接表达无标签重组蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化。

 

3.如果需要表达的蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫后获得的抗体进行WB实验，灵敏度较高。

 

五、Q:什么情况下建议选择大肠杆菌表达系统？

A:大肠杆菌表达系统是常用蛋白表达系统，优势包括遗传背景清晰、成本低、表达量高、易于放大和时间短等，缺点是容易形成包涵体和无法进行翻译后修饰。该系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白，特别是小分子蛋白。如果您感兴趣的蛋白符合这种情况，建议选择原核表达系统。

 

六、Q:在大肠杆菌蛋白表达系统中，义翘神州能解折叠不溶蛋白吗？

A:是的。我们的科学家在蛋白质解折叠方面拥有丰富的经验。选择哪种蛋白解折叠策略需要根据蛋白质的序列和结构特性来确定。

 

目前义翘神州提供从密码子优化到重组蛋白表达/纯化的一站式服务以及内毒素去除等附加服务，以满足不同的定制需求。我们拥有丰富的E. coli 可溶性蛋白表达/纯化及蛋白复性经验，拥有多种E. coli细胞株和表达载体，可为客户提供优质的原核蛋白表达服务。更多详情可以参看：https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service