双特异性抗体制备方法有：化学偶联法，杂交—杂交瘤法，基因工程抗体制备法（常用也），下面是具体的介绍:
1、化学偶联法
顾名思义，简单来说，就是听过化学偶联剂，将两个片段偶联所得。比如，我们可以通过二马来酰亚胺、二硫代酰基苯甲酸等试剂，来连接连个完整的IgG的片段，或两个F(ab)2抗体片段偶联成一种BsAb。这个方法相对来说简单便捷，但是容易破坏抗原结合部位从而造成抗体活性降低，而且偶联剂本身存在一定的安全隐患和致癌性;
2、杂交瘤融合法
和杂交瘤细胞的制备方式类似，杂交瘤融合法其实就是将两株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后再通过筛选和扩增，从中选择出合适的靶细胞;
3、基因重组法
基因重组是BsAb制备中常用的方法，其原理是通过基因工程技术对抗体进行基因改造，从而形成我们所需功能的双特异性抗体;
双特异性抗体常见问题解答
①双特异性抗体的优势是什么？
? 双特异性抗体特异性高、靶向性强、可以同时识别两种抗原分子；
? 相对于两种单抗药物联合用药的治疗方法，双特异性抗体药物减少了开发和临床试验的成本；
? 双特异性抗体的治疗效果明显优于两种或多种单抗联合应用；
? 相对于多种单抗联合应用，双特异性抗体的副作用较小，改善了药物的安全性和有效性。
②双特异性抗体有哪些形式？
双特异性抗体根据是否有Fc结构分为IgG和非IgG型两大类：IgG-like主要形式有Crossmab,Triomabs, kih-IgG等；非IgG-like主要形式有TrandscFv, BiTE, DART, TandAb，F（ab'）2, bio-Nanobody等。
③对于双特异性抗体，如何选择合适的表达系统？
选择合适的表达系统对于双特异性抗体的高效表达和生产至关重要。对于一些非IgG bsAb，如BiTE和串联双特异性scFv，它们可以在酵母或哺乳动物细胞（包括CHO和HEK293细胞）中表达，虽有文献报道可使用大肠杆菌表达scfv类片段抗体，然而由于此类宿主细胞缺乏必要的翻译后修饰机制，表达的scFv分子缺乏结构域内二硫键的形成，然而这对“免疫球蛋白折叠”结构至关重要。通常需要额外的蛋白质复性和回收步骤来生成可溶性scFv分子。为了解决这些问题，可以选择哺乳动物细胞表达双特异性scFv，因为它们能够进行复杂的翻译后修饰。
④如何对双特异性抗体进行设计？
初，使用四源杂交瘤（杂交-杂交瘤）来生产双特异性抗体。由于随机组装4条不同的多肽链（2条不同的重链和2条不同的轻链），只有1种功能性双特异性抗体，其余9种为单特异性抗体和无活性抗体。这导致目标bsAb的产量较低，给下游纯化工艺带来了巨大挑战。
为了克服重链和轻链的连接问题，科学家们利用重组DNA技术对双特异性抗体进行改造。双特异性抗体根据不同的特性分为两类：IgG样bsAb和非IgG样bsAb。IgG样双抗具有保守的免疫球蛋白恒定区，因此保留了Fc介导的效应功能，如CDC和ADCC。IgG样双抗不仅分子量大，还具有较长的血清半衰期、较好的溶解度和稳定性。非IgG样双抗相比之下，由于缺乏Fc片段，具有体积较小、免疫原性低和组织渗透性好等特点，但在血清中的半衰期更短。
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