抗体是生物体内重要的免疫分子,它们能够识别并攻击外部入侵者,如病毒和细菌。在医学、生物学和免疫学等领域,抗体标记与检测技术广泛应用于疾病诊断、治疗监测、药物研发等方面。本文将详细介绍抗体标记与检测的种类和方法,包括直接标记、间接标记、免疫荧光、酶联免疫吸附试验等。通过对这些技术的了解和应用,我们可以更好地利用抗体进行疾病诊断和治疗监测,提高医疗水平和治疗效果。

 

1.抗体与标记物

 

抗体广泛应用于多种免疫分析中,用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗(primary antibody),赋予检测的特异性。同时,在检测中还需加入标记物(详见后文“间接标记法 Vs.直接标记法”),标记物的加入赋予可检测性。表1中列出了一些常用的免疫分析技术,及可能使用到的标记物。

 

 

免疫分析方法

标记物

免疫印迹(WB)

酶(通常为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP)

酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶、生物素/链亲和素

免疫荧光(Immunofluorescence)

荧光染料

免疫组化(Immunohistochemistry)

酶、生物素/链亲和素

流式细胞术(Flow Cytometry)

荧光蛋白或染料、串联染料

 

 

2.直接检测法 Vs.间接检测法

 

检测技术可分为两大类:直接法和间接法。对于直接检测法,标记物通过共价键连接到一抗上。而对于间接检测法,标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。

 

在间接法中,检测由两个部分组成:步,用未标记的一抗进行孵育(通常1小时),(若存在抗原)部分抗体与抗原结合,未结合的抗体则通过洗涤去掉,然后加入标记二抗。再次孵育(通常1小时),洗涤去掉未结合的二抗。然后对结合在抗体上的标记物进行量化。若有抗原存在时,标记物通常导致有色物质的生成或某一个波长的发射光量增加。当无抗原存在时,则无一抗的结合,也无二抗试剂的结合,因此无信号产生。

 

在直接法中,标记物直接与一抗共价结合,因此仅需一轮孵育及洗涤步骤,而间接法则需要两轮孵育及洗涤步骤。直接法简化了试验的流程,但检测的灵活性降低。下表列举出了直接法/间接法的主要利弊。

方法

优点

缺点

直接法

仅需使用一抗,检测快速
无二抗的非特异性结合

由于标记可能导致一抗的免疫反应性降低;
信号放大作用较弱

间接法

一抗含有多个标记,二抗可结合的表位,因而灵敏度升高,信号放大作用较强。

二抗可能发生非特异性结合;
孵育及洗涤步骤增多

 

 

 

尽管直接标记法具有诸多潜在的优点,但为何如今众多的免疫分析仍采用间接法原理呢?

 

无疑,主要的原因就是直接标记一抗相对较复杂,确实从历来经验看,抗体标记都是由那些具有化学修饰技术的人员来完成的。在间接法中二抗试剂所起的信号放大效应究竟如何呢?是否直接标记法所产生的信号就很弱?其实在很多情况下,间接法的放大效应是让人产生错觉的。在与二抗试剂的孵育过程及洗涤过程中,一些一抗会与抗原发生解离,因此真正被放大的只是逐渐减少的一抗的量。其实在很多情况下,直接法也可获得与间接法相同甚至更好的结果。

 

3.常见的抗体标记方法

和所有蛋白质一样,抗体也是由氨基酸组成的。理论上,通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。以下内容介绍了几种基于赖氨酸残基的抗体偶联和标记技术。

 

 

①NHS(琥珀酰亚胺)酯法

应用广泛的荧光染料(如罗丹明衍生物)是采用这种方法对抗体进行偶联。通常在磷酸盐缓冲液中进行,随后与未标记的染料在柱上进行分离。该方法的主要缺点是,由于酯类对水分敏感,酯类的稳定性差。因此,反应结束后,标记抗体应立即使用。

 

吉妥珠单抗(Gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg?)是全球范围内获批上市的抗体偶联药物(ADC)。半合成的卡奇霉素衍生物具有NHS酯,以便将卡奇霉素与人源化IgG4的赖氨酸残基偶联。然而,由于患者的临床获益不足,Mylotarg?已于2010年退市。

 

 

②异硫氰酸盐法

这种方法主要用于异硫氰酸荧光素(FITC)染料的偶联,广泛用于荧光标记蛋白和抗体的制备。异硫氰酸盐比NHS更稳定,但也更难制备,而且利用该方法,标记的反应效率可能会降低。与NHS法一样,应在反应结束后通过层析法去除多余染料。

 

 

③碳二亚胺法

碳二亚胺衍生化合物将蛋白质上的羧基转换为反应中间体,可与赖氨酸发生反应。碳二亚胺的高反应性意味着它们可用于使用相对惰性的材料(如磁性或金颗粒)标记抗体。常用的碳二亚胺为EDC。NHS有时可被添加至反应中,以辅助产生相对稳定的中间体。

 

该方法操作简单,但与NHS一样,EDS具有吸水性,因此,标记后抗体需立即使用。

 

 

④高碘酸盐法

这种方法可用于制备特异性的HRP标记抗体。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活HRP。HRP本身只有少量的赖氨酸残基,因此酶聚合的影响不大。HRP和抗体之间的键是可逆的,可通过添加氰基硼氢化钠使其保持稳定。