无细胞表达系统是一种在生物制药和基因疗法领域广泛应用的生物技术。尽管它带来了许多优势，如高表达水平和翻译后修饰，但无细胞表达系统也存在一些常见问题和挑战。本文将详细解答这些问题，并提供相应的解决方案。
Q1:无细胞合成（CFPS）体系相对于细胞体系有哪些优势？
A1: 无细胞表达系统的优势主要体现在：
? 可自动化操作简便、快捷——成本低（无需培养细胞和细菌相关的场地设施）、表达时间短（3h）、单位表达量高。
? 蛋白表达工程化（Cell-free protein engineering）——无细胞合成系统作为一个开放式的系统，可以向体系中自由添加所需的成分以调控蛋白的正确合成。例如可以向系统中加入Fe2+、Mn2+和Cu2+等金属离子促进含有对应离子蛋白的正确合成；可以有效表达抗菌肽等毒性蛋白并实现规模化目的蛋白的生产。
? 适合原型研究（cell-free prototyping），整体原料均为外加，活性物质之间发生的化学酶促反应使整个过程相对可控。
Q2:真核来源的蛋白是否必须用真核表达系统？
A2:并非如此，真核来源的蛋白除了传统的哺乳动物表达系统，还可以利用无细胞蛋白合成。无细胞系统是一套酶促级联反应，可以添加很多其他组分甚至是真核来源的提取物来实现真核蛋白的表达。如果某些目标蛋白（比如抗体功能性片段scFv和VHH）的功能不依赖翻译后修饰，在这种情况下，不管是无细胞系统还是HEK293系统，两者表达的活性无明显差异。
Q3:无细胞合成系统是否适用于高通量，表达量如何？少量蛋白的检测是否也适用？
A3:无细胞表达系统非常适合高通量表达，其产量可到 mg/mL 级别，抗体和抗体功能性片段是 100 μg/mL 级别。对于少量蛋白的检测需要建立相应的检测方法，如您想进一步了解，我们可以协助进行方法学的设计。
Q4:对于原核体系难以表达的真核来源蛋白，无细胞表达体系有什么优势吗？
A4:因为其开放式系统可以添加很多其他组分甚至是真核来源的提取物来实现真核蛋白的正确合成。例如我们聚焦的VHH、VHH-Fc等都可以实现无细胞系统中上清表达，但是这些蛋白在原核表达中往往以错误的形式存在。
Q5: 我在无细胞表达系统中进行表达，但蛋白总是以低表达水平出现，如何解决？
A5: 低表达可能是由于反应条件不当或蛋白的折叠不完整。您可以尝试优化反应条件，如调整温度、pH值和反应时间，以提高蛋白的表达水平。同时，添加适当的蛋白辅助因子或分子伴侣，有助于促进蛋白的正确折叠和表达。
Q6: 以不溶性形式表达，该怎么解决？
A6: 蛋白不溶性表达可能是由于蛋白的折叠不正确或缺乏正确的蛋白折叠因子。您可以尝试添加蛋白折叠辅助因子，如小麦胚芽提取物，有助于促进蛋白的正确折叠和溶解性。此外，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于提高蛋白的溶解性。
Q7: 形成夹杂物，导致纯化困难，有什么解决办法？
A7: 夹杂物的产生可能是由于蛋白的折叠不正确或反应条件不适合。您可以尝试添加蛋白辅助因子或分子伴侣，如chaperonin，来帮助蛋白的正确折叠和防止夹杂物的形成。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少夹杂物的产生。
Q8: 出现部分降解，如何解决？
A8: 蛋白降解可能是由于蛋白的不稳定性或存在蛋白酶的活性。您可以尝试添加蛋白酶抑制剂，如苯甲酸，来减少蛋白的降解。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于提高蛋白的稳定性。
Q9: 出现异常修饰，如何解决这个问题？
A9: 蛋白异常修饰可能是由于无细胞表达系统中存在的特定修饰酶。您可以尝试选择不同的表达系统或添加特定的修饰酶抑制剂，来减少蛋白的异常修饰。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少蛋白的异常修饰。
Q10: 形成聚集体，导致纯化困难，如何解决？
A10: 蛋白聚集体的形成可能是由于蛋白的折叠不正确或反应条件不合适。您可以尝试添加蛋白折叠辅助因子或分子伴侣，如小麦胚芽提取物，有助于促进蛋白的正确折叠和防止聚集体的形成。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少聚集体的产生。
A10: 高背景信号可能是由于蛋白的非特异性结合或存在夹杂物。您可以尝试优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，来减少非特异性结合。同时，使用适当的纯化方法，如亲和层析或凝胶过滤，可以帮助减少背景信号。另外，您还可以使用合适的对照实验来验证蛋白的特异性结合，以确保蛋白表达的准确性和可靠性。
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