多重免疫组化（荧光）染色技术，以其高描绘肿瘤微环境中肿瘤与免疫细胞状态的能力，为肿瘤的精准诊断提供了不可或缺的参考信息。该技术不仅深入揭示了免疫细胞亚群的比例和分布，还特别关注免疫细胞与肿瘤细胞间的空间关系，这些关键信息对于肿瘤预后评估和免疫治疗策略制定具有重大意义。

 

mIHC还可通过与组织芯片、转录/蛋白组测序、单细胞测序等技术相结合，去完成各项高通量检测技术的验证任务。根据不同的原理，有不同的方法。下面我们就来一起来了解下这5类常用的技术。

 

1.染色去除技术

作为mIHC常用的方法之一，染色去除技术在不同的平台上被开发出来用于研究肿瘤组织样本。该技术的基本原理是清除样品中的一种标记后，再用一种新的不同标记对样品进行染色，并重复该过程，并实现在单个样品中检测多种抗原，不同的染色去除技术。

 

 

2.荧光基团失活技术

荧光基团失活技术（Fluorophore inactivation technologies）的技术原理与荧光去除技术的原理大体相似。差别在于，它不是通过改变pH条件，变性、光漂白来去除荧光，而是通过化学灭活来消除荧光基团。

 

在该技术原理基础上开发的芯片式成像深度分析系统（ChipCytometry），是一种基于成像的细胞术平台，结合了多重标志物显微成像和流式数据分析法，从根本上实现了对传统方法的各类局限的突破，并可以对细胞和组织切片的生物标志物的表达和空间分布进行成像可视化检测分析。德国柏林-勃兰登堡再生医学中心也借助该技术完成了人胎盘冷冻切片中原位检测间充质干细胞（MSCs）多种表面标志物如CD73/CD90/CD105/CD45/CD34/CD19的表达及空间分布分析。

 

3.多重信号放大技术

为了克服检测低表达抗原的局限性，随着科技的发展，多重信号放大技术应运而生。该技术包括基于多重修饰半抗原、酰胺信号放大（TSA）和纳米晶体量子点等。

 

其中，TSA是常用的多重信号放大技术之一。TSA是在传统的免疫组化染色基础上，基于信号分子沉淀原理，在H2O2存在时，抗体上标记的HRP将荧光物质标记的底物酪胺（t）转化为具有短暂活性的中间状态（t*），然后被激活的底物分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域（酪氨酸残基）进行稳定的共价结合；由于相接蛋白（抗原、HRP等）都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使得信号被有效放大。

 

经过多轮不同种类荧光物质标记的底物酪胺的染色，即可在一张样本上实现多色免疫荧光标记。TSA技术的优点是，可通过共价结合的方式将荧光信号结合到目标样本上，不易丢失，且经HRP放大后信号更强。缺点则是由于荧光信号的交叉作用，针对一份样本染色种类较多时，容易出现串色的情况（这一点ChipCytometry技术倒是做的很好），也因此，多色标记的数量受到了限制，多仅能做到在一张样本切片上进行4～7色的荧光染色。

 

 

4.DNA条形码技术

DNA条形码技术（DNA Barcoding Technologies）是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段（DNA barcode）在物种种内的特异性以及种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，该技术利用DNA的特性，可以达到扩展mIHC能力的目的。基于DNA条形码技术开发的mIHC技术种类较多，这里我们简单介绍下，空间多靶标分析技术（Digital Spatial Profiling，DSP）是一种基于紫外光可切割的寡核苷酸标签，可与抗体或mRNA杂交探针耦合，来检测蛋白质与RNA的高复杂度空间信息的分析方法。该技术使用紫外线将抗体上的高聚寡核苷酸标签解耦，并从组织表面提取，使样品可以重复使用。寡核苷酸条形码再经过定量分析，并反应组织的空间原位信息，可以帮助研究者在复杂的疾病或是组织中快速、精准地量化其异质性，有助于生物标记的发掘及疾病致病机理的深入研究。DSP已被成功用于分析接受检查点阻断治疗的黑色素瘤患者的肿瘤特征，并证明基线免疫浸润与治疗反应之间存在相关性。

 

 

5.质谱流式细胞技术

质谱流式细胞技术（Mass Cytometry）是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它既有传统流式细胞仪高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。

与传统流式细胞技术的差别在于：

、传统流式使用各种荧光基团作为抗体的标签，质谱流式则使用各种金属元素作为标签；

第二、传统流式使用激光器和光电倍增管作为检测手段，质谱流式则逐个通过ICP质谱检测装置，对每个细胞中各种金属标签进行定量检测，进而得知每个细胞中各目标蛋白的含量。应用该技术所引申出的mIHC技术。

 

成像质谱流式技术（Imaging mass cytometry，IMC），其实是将免疫组化方法与经过充分验证的CyTOF（质谱流式）技术完善融合，可以生成细胞标志物、转录产物以及转导信号等多种因子的组织结构图像。

 

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