酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种高灵敏度的免疫分析方法，通过将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合，以及抗体或抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现对目标物的高检测。其检测灵敏度可达到皮摩尔（pmol）级别，为生物医学研究、临床诊断等领域提供了强有力的技术支持。

 

技术原理

 

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

（1）将已知的抗体或抗原精细地结合在某种固相载体上，确保其免疫活性得以完好保存。

（2）在测定过程中，待检样本与固相载体表面吸附的抗体或抗原按照特定的顺序进行反应。

（3）通过一系列的洗涤步骤，将抗原-抗体复合物与游离成分彻底分离。

（4）加入特定的酶作用底物，催化显色反应，从而实现定性和定量的检测。

 

 

ELISA常见类型

 

1、直接法：

 

将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。

 

优缺点：

适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验灵活性低，灵敏度低。

 

2、间接法：

 

将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

 

优缺点

常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。

 

3、夹心法：

 

类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

 

直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

 

优缺点

常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

 

4、竞争法：

 

首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

 

优缺点：

常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。 缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

 

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