多重荧光免疫组化(TSA技术)是一种基于酪胺信号放大技术的染色方法,利用抗原抗体反应对样本中的多种蛋白标志物进行荧光染色标记。这种技术能在同一组织切片上实现多个靶标蛋白的共染色,多可同时标记数十种蛋白,从而揭示组织微环境中的复杂信息。通过荧光图像分析,我们可以进行定量分析、细胞分型、以及空间关系分析等多方面的深入研究。

 

一、技术原理

 

酪酰胺信号放大(TSA)技术利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记。在H2O2环境下,荧光标记的酪胺分子被HRP催化激活,产生大量酶促反应,使荧光素与抗原紧密结合部位沉积,实现信号放大。TSA技术通过循环使用不同荧光染料,可在一张组织切片上实现多种蛋白的共染色。

 

二、优势

 

①TSA技术能够显著增强荧光放大信号,其增强幅度大约是普通荧光的3~10倍,使得检测更为敏感和准确。

②在TSA技术中,一抗抗体的种属来源不受限制。不同于普通荧光免疫组化共染的要求,TSA技术每一轮染色后可以将上一轮的一抗和二抗洗掉,对后续染色无影响。这意味着同一种属来源的一抗并不会影响实验结果,为实验提供了更大的灵活性。

③在TSA技术的实验过程中,无需严格避光。这是因为荧光素具有较高的稳定性,不易淬灭。即使在实验操作过程中没有采取避光措施,也不会对实验结果产生影响。更为便利的是,染色后的玻片可以保存数月之久而不发生淬灭,方便后续重新扫描和分析。

 

三、注意事项

 

①在准备染料时,要确保完全溶解并混合均匀。若试剂含有有机溶剂并出现沉淀,需先行过滤。

②实验过程中,要防止切片干燥并注意避光,以保持荧光染料的稳定性,防止其淬灭,从而提高实验的准确性和可靠性。

③选择高特异性的抗体是关键,它能更准确地识别目标蛋白,减少非特异性染色,从而提高实验的敏感性和特异性。

④选择荧光染料时,要根据抗体的表达量来搭配。表达量高的应与弱光搭配,而表达量低的应与强光搭配,以平衡不同抗体间的荧光强度,使实验结果更准确可靠。

⑤在实验前,务必制定详细的方案,包括确定染色顺序、修复条件和每一种抗体所搭配的荧光染料。通过合理的方案设计,可以确保实验的顺利进行,提高实验的一致性和可重复性。

 

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