亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是有效的纯化方法,通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白,同时去除溶液中的污染物或其他分子,并一步富集或纯化目标分子,使其与其他不能结合配体的分子分离。

 

除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外,亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白,而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性强的。下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项!

 

一、Ni柱进行蛋白纯化时注意点:

 

(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:NH4,甘氨酸,精氨酸,等等;

(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂,如EDTA,EGTA,等等;

(3)各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如DTT,防止二价Ni被还原;

(4) 不能含离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失;

(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如0.1-1mM的PMSF,防止目的蛋白被降解;

(6)缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度可达50%(v/v)

(7)应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;

(8)缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间;

(9)可加入变性剂促溶,盐酸胍(可6M),尿素(可8M)

(10)可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween,NP40等,2%,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;

 

二、 gst柱进行蛋白纯化时注意点

 

(1)在细胞裂解时,加入终浓度1–10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率, 在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1–10 mM DTT,可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低

(2)超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。

(3)在pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低,使用前需用pH6.5~8.0的Buffer如PBS进行平衡;

(4)增大Elution Buffer的pH值。Elution Buffer的pH值调至pH 8–9可以提高洗脱效率而不需要增加glutathione的浓度;

(5)增加Elution Buffer的离子强度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脱效率;

(6)Elution Buffer中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍GST融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以显著增加洗脱效率

 

三、 proteinA柱进行蛋白纯化时注意点

 

(1)介质的选择A,G or 其他,其结合能力的选择

(2)上样流速尽量小,让Protein G和抗体有充分的结合时间

(3)在低pH值洗脱后,快速中和。

(4)长时间保存加入0.02-0.05%叠氮钠;

(5)加入10%甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。

(6)抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。