制备单克隆抗体的技术：

①杂交瘤技术

1975年，首次利用杂交瘤技术在小鼠体内制备了单克隆抗体。杂交瘤制备包括对某一物种的抗原上的特定表位进行免疫，并且从动物脾脏中获得了B淋巴细胞。将B淋巴细胞（通过化学或病毒诱导的方法）与缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因且不含任何其他产生免疫球蛋白细胞的永生骨髓瘤细胞系融合。然后将这些杂交瘤细胞在选择性培养基（即含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷的培养基）中进行体外培养，其中只有杂交瘤（即原代B淋巴细胞和骨髓瘤细胞之间的融合体）才能存活，因为它们从骨髓瘤细胞继承了永生性，并从原代B淋巴细胞继承了选择性抗性（由于骨髓瘤细胞缺乏HGPRT，它们不能重新合成核苷酸，因为这被选择性培养基中的氨基蝶呤抑制）。

 

杂交瘤的初始培养物含有来自许多不同的原代B淋巴细胞克隆的抗体混合物，每个混合物都将其自身的特异性抗体分泌至培养基中（即抗体仍为多克隆）。通过稀释法将每个单独的克隆分离至不同的培养孔中。可从数百个不同的孔中筛选出细胞培养基以获得所需的特异性抗体活性，从阳性孔中培养所需的B淋巴细胞，随后进行再次克隆和再次检测活性。制备的阳性杂交瘤和单克隆抗体可储存在液氮中。

 

 

②噬菌体抗体库技术

另一种制备单克隆抗体的方法是利用噬菌体抗体库技术。这包括从人血中分离B淋巴细胞，然后分离mRNA，并利用PCR技术将其转换为cDNA，以扩增所有VH和VL片段。然后，这些片段可以被克隆到噬菌体PIII蛋白旁边的载体中（通常为scFv），然后用于感染大肠杆菌，通过接种额外的辅助噬菌体库产生一个大约包含1010个细胞的库。

 

随后，大肠杆菌可以分泌包含VH和VL片段的噬菌体，作为噬菌体外壳的一部分。然后，可以选择针对抗原的特异性VH和VL片段，并以噬菌体对大肠杆菌进行再接种。随后，可以分离包含质粒的细胞，并进行测序。其优势包括：一旦制备了库后，可以使用相同的库制备新型抗体，无需制备新库。由于该过程发生在体外，无需进行免疫，可以比传统的杂交瘤技术更快地获得抗体，且该库可用于生成无法用于免疫动物的有毒抗原的抗体。

 

 

③单B细胞抗体技术

这种从人类单个B淋巴细胞制备单克隆抗体的方法是通过应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和表达载体克隆，在单细胞水平上分析免疫球蛋白基因重现和反应性。

 

通过识别选定的细胞表面标记物，分离出小鼠或人类B淋巴细胞（如通过荧光激活细胞分选），通过RT-PCR分别扩增编码VL和VH片段的基因，并通过PCR结合。为了终在体外制备人源单克隆抗体，在克隆和哺乳动物系统中表达之前，每个细胞的H和L链基因转录物通过RT-PCR扩增。这种方法的优势在于能够在短时间内制备许多特异性人源单克隆抗体。

 

 

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