WB(蛋白质印迹)是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为SDS-PAGE、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面义翘神州针对WB在实验过程中遇到的问题进行罗列及解答：
1、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？
请您检查所使用的封闭液并注意封闭以及洗膜的时间。有两种常用的封闭液：脱脂奶粉或BSA。脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白的封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合在膜上并与磷酸化特异性抗体结合导致高背景。并且稀释抗磷酸化酪氨酸抗体与脱脂奶粉中的酪蛋白结合后，用于检测的抗体较少导致信号减弱。此外，避免封闭时间过长，否则会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致高背景。
我们建议使用含1% BSA的TBS，含吐温20作为封闭液，请勿使用脱脂奶粉。
2、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？
如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，可能的原因及解决方案如下：
①可能的原因一：使用了不同的样本。 解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。
②可能的原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。 解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。
③可能的原因三：抗体被污染。解决方案： 旋转小瓶，检查是否有沉淀。
④可能的原因四：二抗失效。解决方案：更换新的二抗。
⑤可能的原因五：蛋白质转膜效率低。解决方案：配置新的转膜液；根据蛋白分子量大小调整转膜时间。
3、如何避免转膜不充分或结果不理想的问题？
确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于180 kDa，则需要通过以下方式优化转膜条件：
? 使用20% MeOH。
? 加入0.05% SDS转膜缓冲液。
? 增加裂解物的上样量。
? 110 V恒压转150 min，湿法转膜。
4、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？
为避免进行蛋白免疫印迹法时出现“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法:
? 延长封闭时间，以优化封闭效果。
? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。
? 在配置封闭液时，确保奶粉完全溶于溶液。
? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。
5、如何避免印迹上出现“点状”、不均匀的斑点？
为避免印迹上出现“点状”或不均匀斑点，请尝试以下几种方法：
? 检查所有缓冲液是否被细菌污染。
? 确保在抗体和清洗孵育过程中膜完全浸入。
? 在转膜时，排除薄膜和凝胶之间的所有气泡。
? 将膜放在摇床上，确保均匀地接触。
? 清洗蛋白免疫印迹所需的设备。
? 过滤HRP结合物，除去任何可能的聚集物。
?减少底物暴露时间。
6、选择什么作为WB抗体的阳性对照？
为了使您的蛋白免疫印迹抗体中获得性能，请使用技术数据表中推荐的阳性对照。阳性对照将帮助您按照制定的方案，在实验中获得准确的结果。
我们建议将这些裂解物放置在-20℃下长期储存。裂解物非常稳定，它们是细胞制剂，所有酶均变性和灭活。我们做了大量的研究，证实了不同条件下的稳定性。例如，大多数裂解物的完整性和质量不受反复冻融的影响，可在25℃下储存长达12周。但裂解物在37°C下4周时开始降解。然而，根据裂解物的来源，稳定性可能存在一些轻微差异，因此我们建议将其储存在-20℃下。
7、应该分析多少蛋白质？
我们建议：
样本类型 每条泳道
全细胞裂解液 50 μg
细胞核提取物 25 μg
8、应该使用多少浓度的丙烯酰胺凝胶来分离蛋白？
为了更好地分离感兴趣蛋白，丙烯酰胺凝胶的百分比应基于蛋白分子量。我们建议：
蛋白大小（kDa） 丙烯酰胺凝胶百分比（%）
< 80 13
> 80 7.5
9、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？
我们建议使用硝酸纤维素（NC）膜。虽然聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、尼龙膜和DEAE纤维素膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是实验过程中使用山羊多克隆抗体。
10、应该使用什么封闭缓冲液？
封闭液的选择与目标蛋白有关，我们建议一般使用1X TBS、5%脱脂奶粉、0.05%吐温-20作为封闭液，在室温下封闭30-60分钟或在4℃下封闭过夜。请注意，如果封闭过夜，缓冲液中应不加吐温-20。如果目标蛋白较特殊（如磷酸化），建议使用1X TBS、1% BSA并含有吐温-20的封闭液，可得到较清晰条带。
11、一抗的稀释倍数一般是多少？
请查看各个抗体的数据表，因为这通常记录起始稀释度。如果数据表上没有具体稀释信息，我们建议您对相关的阳性和阴性对照进行连续滴定。
12、为什么实际的蛋白免疫印迹条带大小与预期的不同？
蛋白免疫印迹法是根据蛋白质大小分离蛋白的技术。一般来说，蛋白越小，其在SDS-PAGE凝胶中移动的速度就越快。然而，移动速率也受到其他因素的影响，因此实际条带大小可能与预测不一致。
可能的原因 备注
①翻译后修饰 例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质的大小。
②翻译后切割 大多数蛋白质首先合成为前体蛋白形式，再经切割产生活性形式，例如前体半胱天冬酶。
③剪接变体 可变剪切会产生从同一基因产生不同大小的蛋白质。剪接变体的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件 。
④亚型 许多蛋白质表达多种不同大小的亚型。相同靶蛋白不同亚型的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件。参照不同的网站，确定特定靶标的亚型。
⑤相对电荷 氨基酸组成（带电vs.不带电）。
⑥多聚体 例如蛋白质二聚化。尽管相互作用可能导致出现较高条带，但在还原条件下需防止该情况。
13、为什么蛋白免疫印迹结果信号微弱或完全没有信号？
可能的原因 备注
①抗体滴定 应使用多种抗体浓度进行抗体滴定实验，以确定信噪比的合适抗体浓度。一般而言，滴定浓度应在0.2-5.0 μg/mL。
②组织/细胞特异性 靶蛋白表达取决于待测的细胞或组织。应进行文献检索，确保您正在使用的细胞等条件适用于检测靶蛋白。
③复溶 在重新溶解冻干抗体时应注意，确保抗体全部溶解。尽管冻干抗体沉淀通常位于试管底部，但有时粉末可能位于管壁上。因此，溶解时应覆盖试管的整个表面，以确保抗体完全溶解。然后进行短暂离心，确保将所有粉末收集在试管底部。
④阳性对照 在您的蛋白免疫印迹中添加阳性对照泳道是评价抗体是否正常工作和实验条件是否适当的方法。另外，基于文献或实验结果的阳性对照也可以用来评估抗体是否正常发挥作用。