GST标签重组蛋白纯化原理：利用层析填料上的还原型谷胱甘肽(GSH)可以与含有谷胱甘肽S转移酶(GST，分子量~26kDa)标签的重组蛋白特异性结合的性质，将重组蛋白从含有杂蛋白的溶液中分离出来。
怎样纯化GST标签蛋白？
为了产生表达GST标签蛋白的构建体，可将编码目标蛋白的序列插入到市售的载体中。除了用于亲和纯化外，GST标签还经常被用于pull-down实验，以研究蛋白间的相互作用。
GST标签蛋白纯化的规模取决于制备蛋白的量。所选择的柱子大小和总结合能力应与待纯化的蛋白量大致匹配。如果靶蛋白几乎占据了所有可用的谷胱甘肽结合位点(GST融合位点)，通常很少有非标签蛋白被保留在树脂上。如果使用的基质过多，其他蛋白可能会非特异性地结合到未被占用的位点。
在GST标签蛋白纯化时，澄清裂解液中含有的GST标签蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH，bind)结合。非结合蛋白从基质中洗涤(Wash)，结合的GST标签蛋白通过加入过量的还原型谷胱甘肽从载体上洗脱(Elute)。
亲和色谱法纯化GST标签蛋白
亲和色谱法是选择性的色谱类型之一，是一种非常实用的蛋白纯化技术。将蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)结构域融合有利于蛋白表达和后续纯化。因此，一般的纯化策略是将GST融合蛋白结合在固定的谷胱甘肽层析柱上，洗去所有其他物质，然后洗脱蛋白。
纯化GST融合蛋白有四个主要步骤：
1.制备谷胱甘肽柱缓冲溶液A
2.谷胱甘肽柱纯化
3.纯化评估
4.在Nap-10色谱柱上去除谷胱甘肽
除了亲和纯化，借助谷胱甘肽配体化学反应或GST标签特异性抗体，如微孔板涂层、蛋白相互作用pull-down实验和ELISA或Western blot，GST标签蛋白的其他应用也成为可能。
GST标签蛋白纯化FAQ：
1）GST标签重组蛋白不能与填料结合
①GST标签未能正确表达→对质粒进行测序确认；使用anti-GST抗体进行Western Blotting鉴定
② GST标签重组蛋白在超声波破碎时发生变性→使用温和的破菌条件，减少功率或使用酶解方式
③使用的平衡/洗杂Buffer不合适→检查溶液的组分及pH，当pH低于6.5或高于8.0时，GST标签蛋白不能与填料结合
④样品中加入了高浓度的还原剂，如DTT→降低还原剂的加入浓度或不加入还原剂
⑤上样的流速过快→对于结合能力弱的GST标签蛋白，降低上样流速
2）纯化产物含有很多杂蛋白
① GST标签重组蛋白在超声波破碎时发生变性→使用温和的破菌条件，减少功率或使用酶解方式
② 层析填料使用过量，产生了较多的非特异性吸附→减少填料的使用量
③ GST标签重组蛋白发生了降解→在破菌时加入蛋白酶抑制剂或使用蛋白酶缺失的菌株表达蛋白
④ GST标签重组蛋白与杂蛋白产生了结合→提高洗杂Buffer的盐浓度，或加入1%的TritonX-100或在平衡液中加入5mM DTT
3）GST标签蛋白不能被洗脱液洗脱下来
① 洗脱液的GSH浓度偏低→增加洗脱液中的GSH浓度，多可增至60mM
② 洗脱液的pH偏低→检查洗脱液的pH，或者将洗脱液的pH增加至9.0进行洗脱
③ 洗脱液的盐浓度偏低→可以适当增加NaCl的浓度，也可尝试在洗脱液中加入0.1% TritonX-100
④ 洗脱液中的GSH被氧化→使用新鲜配制的洗脱液
⑤ GST标签重组蛋白发生了降解→在破菌和洗杂时加入蛋白酶抑制剂或使用蛋白酶缺失的菌株表达蛋白